一、匀浆介质
一般采用 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客 户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。
二、组织匀浆的制备
1、取组织块(0.2g~0.5g)最少可到 5~10mg 在冰冷的 PBS 中漂洗,滤纸拭干,准确称重,放入 5ml 的匀浆管中。
2、按重量(mg):体积(ml)=1:4 的比例加入 4 倍体积的匀浆介质于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪尽快剪碎组织块。
3、匀浆的方式:手工 Elfin 匀浆,机器匀浆。
手工匀浆:左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将 Elfin 匀浆捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8 分钟),充分研碎,制成 20%的匀浆液。
机器匀浆:用 GD200 组织捣碎机 10000~15000 转/分 上下研磨制成 20% 组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间 10 秒/次,间隙 30 秒,连续 3~5 次,在冰水中进行,可适当延长匀浆时间),
镜检观察:取少量组织匀浆作涂片(直接涂片、染色均可以),显微镜下观察细胞是否破碎,若没有则可延长匀浆时间。
4、将制备好的 20%匀浆液用普通离心机或低温低速离心机 4000 转/分左右,离心 10~15 分钟,取上清液进行测定.
三、样本保存:
植物组织样本暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中间如不反复冻融,-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。
制备好的匀浆液建议不要冻存,最好当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降,部分指标 4℃可存放 3~5 天(如 SOD 要存放 2~3 天,MDA 可存放 3~5,总蛋白测定可存 5~7 天等)
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